ارزش تشخیصی و استانداردسازی هموگلوبینA1C

ارزش تشخیصی و استانداردسازی هموگلوبین A1C

  • دکتر محمدرضا بختیاری
    (دکتری علوم آزمایشگاهی، متخصص بیوتکنولوژی پزشکی)
    عضو هیئت علمی پژوهشکده زیست فناوری سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران

خلاصه

سالهای متمادی است که اندازه گیری هموگلوبین A1c یا HbA1c برای پایش و کنترل بیماری دیابت ملیتوس شناخته شده است. این آنالیت منعکس کننده گلوکز میانگین طی 2 تا 3ماه گذشته در خون بیمار بوده و میزان آن با عوارض دیابت بر عروق کوچک و تا حد کمتری عروق بزرگ همبستگی مستقیم دارد. از این رو تعیین درصد آن بطور گسترد های جهت مدیریت میزان گلوکز خون در بیماران شناخته شده بکار می رود. از سال 2009 کمیته ای بین المللی بر مبنای شواهد فراوان همه گیری شناسی توصیه نمود که از اندازه گیری HbA1c می توان برای تشخیص اولیه بیماری دیابت ملیتوس نیز استفاده کرد. اما به این شرط که روش اندازه گیری استاندارد و تأیید شده باشد. در مقاله پیشرو سعی بر این است که ضمن مرور ساختار و ارزش تشخیصی HbA1c ،به بررسی مسائل قابل توجه مربوط به استانداردهای اندازه گیری آن پرداخته شود.

واژه های کلیدی: دیابت، تشخیص، هموگلوبین قندی شده، HbA1c

مقدمه

βN-1-deoxyfructosyl-hemoglobin ساختار شیمیایی A1C هموگلوبین می باشد که محصول واکنش غیرآنزیمی قندی شدن اسیدآمینه والین انتهایی زنجیره های بتای ملکول هموگلوبین می باشد. در واقع زنجیره های هموگلوبین مانند بسیاری از پروتئینها در بدن در اثر یک سری واکنشهای غیرآنزیمی با ملکولهای گلوکز راه یافته به درون گلبولهای قرمز ترکیب شده و به هموگلوبین قندی شده پایدار تبدیل می گردند بطوریکه هرقدر غلظت گلوکز و مدت زمان مواجهه آن با هموگلوبین بیشتر باشد، درصد بالاتری از هموگلوبین قندی می شود که تا پایان عمر گلبولهای قرمز در آن باقی می مانند. لذا هرقدر درصد هموگلوبین قندی شده بیشتر باشد نشان دهنده عدم یا ضعف کنترل میزان قند خون بیمار در دو یا سه ماه گذشته می باشد. هموگلوبین قندی شده می تواند شاخصی از میزان قندی بودن سایر پروتئینها باشد چون هموگلوبین تنها پروتئین بدن نیست که قندی می شود بلکه این فرآیند تقریباً برای تمام ملکولهای پروتئینی داخل و خارج سلولی رخ می دهد و اصولا نوعی تغییرات ، پس از ترجمه پروتئینها محسوب می گردد بدیهی است چنانچه این تغییرات بیش از حد باشد می تواند در بسیاری از پروتئینها تغییرات در عملکرد و خواص آنتی ژنیک ایجاد نموده و بخش اعظم عوارض دیابت را ناشی از این پدیده می دانند که از این میان، نورولوژیکوایمونولوژیک ، عوارض قلبی- عروقی از اهمیت زیادی برخوردار است.

واکنشهای قندی شدن هموگلوبین

در شکل 1 واکنشهای شیمیایی قندی شدن هموگلوبین مشاهده می شود:

شکل 1 - قندی شدن هموگلوبین

همانطور که در شکل دیده می شود در ابتدا گروه آلدئیدی گلوکز با گروه های آمین زنجیره های هموگلوبین باز شیف ایجاد می کند که آلدایمین ناپایداری است و می تواند در یک واکنش تعادلی تجزیه شده و به ملکولهای اولیه برگردد و یا واکنش به سمت راست پیشروی کرده و با جابجایی باند مضاعف از حالت کربن = نیتروژن به کربن = اکسیژن، باز شیف مذکور به ملکول دیگری به نام محصول آمادوری تبدیل گردد که یک کیتوآمین است. این واکنش نیز تعادلی است و بر اساس اصل لوشاتلیه چنانچه غلظت گلوکز در دسترس زیاد باشد باز شیف افزایش یافته و واکنش بطور کلی به سمت راست میل کرده و لذا محصولات حدواسط و نهایی گلیکاسیون که بسیار پایدارهستند تولید می شوند

از آنجایی که واکنشهای فوق غیرآنزیمی است، نباید واژه گلیکوزیلاسیون 4 به آنها اطلاق شود بلکه واژه گلیکاسیون صحیح است.

انواع هموگلوبین قندی شده و روشهای اندازه گیری آنها

 همانطور که میدانیم هموگلوبین اصلی در بالغین HbA است. آن بخش از هموگلوبینAرا که طبق واکنش فوق قندی شده  HbA 1 و بقیه را که قندی نشدهHbA0می نامند. بدیهی است وقتی گروه های آمین با قند درگیر می شوند از بار مثبت هموگلوبین کاسته شده و انتظار داریم در کروماتوگرافی تعویض کاتیون،جزء HbA 1 با سرعت بیشتری نسبت به HbA0 حرکت کرده و از ستون خارج شود؛ یا در الکتروفورز هموگلوبین روی ژل استات سلولز (ph=8.4) باند HbA1  سریعتر از HbA0 حرکت کند که این موارد اساس تعیین نسبتHbA1 /HbA0 را بر اساس بار الکتریکی تشکیل می دهد.

البته از روشهای کروماتوگرافی تمایلی، شیمیایی و ایمونولوژیک هم می توان برای اندازه گیری استفاده نمود.هموگلوبین قندی شده یاHbA  1 خود حداقل از سه جزء اصلی تشکیل می شود که عبارتند از HbA1b، HbA1a و HbA1c. اختلاف این سه در نوع قند متصل شده به هموگلوبین است به عنوان مثال قند HbA1a فروکتوز -6-1 دی- فسفات یا گلوکز- 6- فسفات است که به ترتیب HbA1a1 و HbA1a2  نام دارند. یا در HbA1c قند از نوع گلوکز است. از آنجاییکه گروه های فسفات در فروکتوز -D-6-1 دی- فسفات یا گلوکز- 6- فسفات خود دارای بارمنفی هستند، لذا HbA1a در روشهای فوق الذکر سریعتر از HbA1cحرکت می نماید. درصد اصلی هموگلوبینهای قندی شده را HbA1c تشکیل می دهد بطوریکه درصد HbA1a و HbA1b ناچیز بوده و ارتباط این دو با کنترل گلوکز مبهم است. جدول 1 درصدتقریبی هموگلوبینهای مختلف را در افراد سالم غیردیابتی نشان می دهد:

درصد تقریبی هموگلوبینهای مختلف در افراد سالم غیردیابتی

لازم به ذکر است که انجمن بین المللی شیمی بالینی (IFCC)با تکیه بر نظرات گروه کاری خود معتقد به مواردی است که برخی از آنها در زیر آمده است:

  • HbA1c آنالیتی است که بطور برگشت ناپذیر از طریق یک یا هر دو والین انتهایی زنجیره بتای هموگلوبین گلیکه شده است.
  • طیف نگاری جرمی 7 و الکتروفورز مویین های 8 روشهای مرجع اندازه گیری HbA1c می باشند و سایر روشها باید بر اساس روشهای مرجع کالیبره شوند.
  •  اندازه گیری و نحوه گزارش نتایج HbA1c باید در سراسر
    جهان استاندارد شود.
  • نتایج اندازه گیری HbA1c با واحد mmol/mol گزارش می شود. البته براساس درصد هم می تواند گزارش شود.
  • می توان برای تفسیر نتایج HbA1c میانگین گلوکز تخمینی برگرفته ازHbA1c را گزارش نمود.

هموگلوبینA1C به عنوان وسیله ای برای تشخیص دیابت

از سال 1997 کمیته ای به نام کمیته بین المللی خبرگان (IEC) متشکل از نمایندگان انجمن دیابت امریکا ، انجمن اروپایی مطالعات دیابت و فدراسیون بین المللی دیابت تشکیل شد تا ملاکهای تشخیص و طبقه بندی بیماری دیابت را تعیین نماید. در گزارش 2008 این کمیته پیشنهاد شد استفاده از HbA1c برای تشخیص دیابت مد نظر قرار گیرد.

در نقطه نظر رسمی سال 2010 انجمن دیابت امریکا 14 ، برای اولین بار HbA1c به عنوان یکی از ملاکهای تشخیصی دیابت ملیتوس ذکر گردید و بیان شد چنانچه غلظت آن برابر 5درصد یا بیشتر باشد یکی از ملاکهای آزمایشگاهی تشخیص قطعی بیماری است که البته این نقطه نظر در بیانیه سال2011 انجمن نیز عیناً تکرار شده است.
این موضوع تحولی مهم در دیابتولوژی محسوب می شود، زیرا اولا سالهای متمادی بود که از سه ملاک میزان گلوکز پلاسما در حالت ناشتا[FPG > 126 mg/dL] ،میزان گلوکز پلاسما به صورت غیر ناشتا یا تصادفی [RPG > 200 mg/dL] و در نهایت میزان گلوکز پلاسما دو ساعت پس از خوردن 75 گرم گلوکز [h PG > 200 mg/dL]برای تشخیص دیابت استفاده می شد که شرایط استاندارد این تست ها را قبلاً در مقاله ای به تفصیل بیان نمودیم. ثانیاً آزمایشHbA1c تا این زمان تنها برای پایش درمان و وضعیت کنترل گلوکز در بیماران دیابتی به کار می رفت و علی رغم مقالاتی که جسته و گریخته منتشر می یافت که در آنها پیشنهاد می شد به دلیل مزایای اندازه گیریHbA1c نسبت به گلوکز می توان از آن برای تشخیص دیابت استفاده نمود اما عموماً کمتر کسی تصور می کرد بتوان از آن به عنوان آزمونی تشخیصی در دیابت استفاده کرد.
نکته قابل توجه اینکه در آخرین نقطه نظر انجمن دیابت امریکا مربوط به سال 2011 تأکید شده است که گرچه عدد 6.5 درصد به عنوان مرز تشخیص دیابت بیان می شود ولی افرادی که HbA1c آنها بین 6 تا 6.5 درصد است تا حد زیادی (با احتمال چندین برابر) در معرض ابتلا به دیابت خواهند بود. حتی کسانی که HbA1c آنها درصد باشد سه تا هشت برابر بیشتر محتمل است که در آینده به دیابت مبتلا شوند. بنابراین برای اولین بار اعلام شده است که در این افراد، یعنی HbA1c بین 6 تا 6.5، هم باید اقدامات پیشگیری از دیابت را آغاز نمود.

به عنوان نتیجه گیری انجمن دیابت امریکا در نقطه نظر 2011 خود توصیه کرده چنانچه HbA1c بین 5.7 تا 6.4 درصد باشد،می توان اصطلاح پیش-دیابت را بکار برد چون ریسک ابتلا به دیابت آشکار در این حالات زیاد است.

 نقاط قوت و ضعف HbA1c برای تشخیص دیابت

در منابع گوناگون مزایای زیاد و معایب قابل توجهی برای استفاده از HbA1c1 در تشخیص بیماری دیابت ملیتوس ذکر می گردد که از میان مزایا می توان به موارد زیر اشاره داشت:

  • عدم نیاز به ناشتا بودن بیمار
  • پایداری بیشتر HbA1c در نمونه نسبت به گلوکز
  • پایین بودن ضریب تغییراتHbA1c در هر فرد و نیز بین افراد (پایداری زیست شناختی)
  •  همبستگی مستقیم قابل قبول (تر) بین غلظتHbA1c و عوارض هیپرگلیسمی
  • وجود روشهای اندازه گیری استاندارد

اما در مورد هشدارها می توان به موارد ذیل اشاره داشت:

  • برخی از هموگلوبین های غیرطبیعی می توانند در روشهای اندازه گیری HbA1c تداخل ایجاد نمایند. مثلاً هموگلوبینهای E و ،F ،C ،Sم یتوانند در برخی از روشهای سنجش اشکال ایجاد کنند. در این موارد روشهای کروماتوگرافی تمایلی کمک کننده خواهند بود.
  • هر علتی که باعث تغییر در طول عمر گلبول قرمز شود، نتایج کاذب ایجاد می کند. مانند آنمی های همولیتیک، مالاریای مزمن، از دست دادن شدید خون یا انتقال خون. در این موارد سابقه بیمار بسیار کمک کننده است.
  • افزایشHbA1c با بالا رفتن سن که به نظر می رسد به عواملی غیر از متابولیسم گلوکز مرتبط است. در سالخوردگان می توان نتایج بالا را با سایر روشها تأیید کرد.
  • تغییرات سطحHbA1c در نژادهای مختلف که نقش تنوع ژنتیکی را مطرح می سازد و البته به نظر می رسد این تغییرات ناچیز باشد.
    برای تشخیص دیابت بارداری به دلیل تغییراتturnover گلبولهای قرمز، نمی توان از HbA1c استفاده کرد.

نکات مهم استانداردسازی روشهای اندازه گیری HbA1c

  • دو نهاد برجسته و شناخته شده برای استانداردسازی HbA1c وجود دارد که یکیIFCC و دیگری NGSP است.
  • وجوه مشرک زیادی بین نظرات NGSP و IFCCدر مورد  اندازه گیری HbA1c وجود دارد. البته مواردی هم اختلاف نظر دارند که شاید یکی از مهمترین آنها واحد بکار رفته برای گزارش میزان HbA1c باشد. همانطور که قبلاً ذکر شد واحد پیشنهادی IFCC عبارت است از mmol/mol در حالیکه واحد توصیه شدهNGSP درصد HbA1c است که البته با رابطه ذیل می توان این دو واحد را به یک دیگر تبدیل نمود:                                                                                        NGSP[%] = [0.09148 * IFCC[mmol/mol]] + 2.152
  • کمیته بین المللی خبرگان(IEC) بطور عمده براساس نظرات دو نهاد فوق الذکر تأکید می نماید:
    – برای گزارش HbA1c از هر دو واحد NGSPو IFCC استفاده شود.
    – برای تشخیص دیابت،HbA1c  اندازه گیری با روشها و تجهیزات بربالین صحیح نیست.
    –  لازم است اندازه گیریHbA1c با استفاده از روشها، کیت ها و تجهیزاتی صورت گیرد که توسط  NGSP تأیید شده است.
    – شرکتهای تولید کننده محصولات مختص اندازه گیری HbA1c خود را بطور منظم به NGSP ارایه می دهند که در صورت اخذ تأییدیه نام و مشخصات کامل این محصولات در سایت رسمی  NGSP قرار گرفته و بروز می شود.
  • با توجه به خطای کمتر پری آنالیتیک و آنالیتیک، اندازه گیری HbA1c مزایای بیشتری نسبت به گلوکز دارد البته درصورتی که تمام نکات استاندارد رعایت گردد.
  • برای بررسی اثرات هموگلوبین های غیرطبیعی بر کارآیی روشها و تجهیزات گوناگون اندازه گیری HbA1c می توان به سایت NGSP مراجعه نمود.
  • برای محاسبه میانگین گلوکز تخمینی می توان از رابطه زیر استفاده کرد:
    eAG (mg/dl) = [28.7 * HbA1c (%)] – 46.7

نتیجه گیری

نظر به اهمیت بحث تشخیص و پایش دیابت ملیتوس،توصیه و به عبارت بهتر تقاضای نگارنده مقاله حاضر آن است که مادامی که استاندارد ملی اندازه گیریHbA1c در کشور تعیین و اجرایی نشده است، استانداردNGSP ملاک عمل قرار گیرد.
برای نیل به این هدف والا رعایت نکات ذیل به صلاح است:
1. شرکتهای وارد کننده تلاش کنند برای واردات محصولاتی سرمایه گذاری نمایند که تأییدیه NGSP را داشته باشند.
2. مقامات مسئول صادر کننده مجوز واردات مواد و تجهیزات آزمایشگاهی در وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی به این امر مهم توجه لازم را معطوف دارند.
3. همکاران مؤسس و مسئول فنی آزمایشگاه های تشخیص پزشکی در سراسر کشور هنگام سفارش و خرید محصولات مرتبط با اندازه گیری HbA1c حساسیت لازم را داشته باشند و تنها محصولاتی را خریداری نمایند که بر روی سایت NGSP در فهرست موارد تأیید شده موجود باشند.باشد که با رعایت این امر بسیار مهم کیفیت اندازi گیری وگزارش نتایج HbA1c در کشور به حد استانداردهای لازم برسد.

منابع

  1. Braga F, et al. Biological variability of glycated hemoglobin, Clinica Chimica Acta 411: 1606–1610, 2010
  2. Bakhtiari, MR. The latest criteria for classification and diagnosis of diabetes mellitus. Laboratory & Diagnosis, 2( 6): 7-14, 2010
  3. Mossalaiee MM. Measurement of fructoseamine in diabetic patients. Clinical Laboratory Doctorate Dissertation, Shahid Beheshti Univer.
    Tehran, Iran, 1993
  4. Hadaegh F, Shafiee G, Ghasemi A, Sarbakhsh P, and Azizi F. Impact of metabolic syndrome, diabetes and prediabetes on cardiovascular
    events: Tehran Lipid and Glucose Study. Diabetes res. clin. prac. 8 (7): 342 – 347, 2010
  5. Gossain VV, Aldasouqi S. The challenge of undiagnosed pre-diabetes, diabetes and associatedcardiovascular disease. Int’l J diabetes
    mellitus, 2: 43-46, 2010
  6. Ristow M. Neurodegenerative disorders associated with diabetes mellitus. J Mol Med. 82: 510-529, 2004
  7. Bakhtiari MR. Assessment of T-lymphocytes proliferative responses to PHA & Con-A in patients with NIDDM. Clinical Laboratory
    Doctorate Dissertation, Shahid Beheshti Univer. Tehran, Iran, 1993
  8. Bakhtiari, MR, Fallahpour M. Molecular mechanisms of diabetes mellitus complications. Proceedings of 2nd international & 7th national
    congress on quality improvement in clinical laboratories. O69, 20-23 April 2009
  9. Huisman TH, Martis EA, Dozy A. Chromatography of hemoglobin types on carboxymethylcellulose. J. Lab. Clin. Med. 52 (2): 312–27,
    1958
  10. Rahbar S. Hemoglobin H disease in two Iranian families. Clinica Chimica Acta. 20 (3): 381-385, 1968
  11. Rahbar S, Paulsen E, and Ranny HM. Studies of an unusual hemoglobin in patients with diabetes mellitus. Diabetes 18 Suppl. (1), 332,
    1969
  12. Rahbar S, Blumenfeld O, Ranney HM. Studies of an unusual hemoglobin in patients with diabetes mellitus. Biochem. Biophys. Res. Commun.
    36 (5): 838–43, 1969
  13. Bunn HF, Haney DN, Gabbay KH, Gallop PM. Further identification of the nature and linkage of the carbohydrate in hemoglobin A1C.
    Biochem. Biophys. Res. Commun. 67(1): 103–9, 1975
  14. Koenig RJ, Peterson CM, Jones RL, Saudek C, Lehrman M, Cerami A. Correlation of glucose regulation and hemoglobin AIc in diabetes
    mellitus. N. Engl. J. Med. 295 (8): 417–20, 1976
  15. Mayo Medical Laboratories. Hemoglobin A1C: Diabetes Diagnosis and Management. http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/
    communique/2009/09.html
  16. Nitin S. HbA1C and factors other than diabetes mellitus affecting it. Singapore Med G. 51(8): 616-622, 2010
  17. Patric JP, Phillipov G. A1C- Frequently asked questions. Austral. Fami. Physic. 34(8): 663-667, 2005
  18. American Diabetes Association, Diagnosis and classification of Diabetes Mellitus, Diabetes care, 34(1) Supl. 1: S62-S69, 2011
  19. www.ifcc.org
  20. The international expert committee. International expert committee report on the role of the A1C assay in the diagnostis of diabetes.
    Diabetes Care. 32(7): 1-8, 2009
  21. American Diabetes Association, Diagnosis and classification of Diabetes Mellitus, Diabetes care, 33(1) Supl. 1: S62-S69, 2010
  22. Kilpatrick ES, HbA1C or glucose for diabetes diagnosis?. Ann Clin Biochem. 42(3): 165-6, 2005
  23. Davidson MB, Peters AL, Schriger DL. An alternative approach to the diagnosis of diabetes with a review of the literature. Diabetes Care.
    18(7): 1065-71, 1995
  24. Saudek CD, Herman WH, Sacks DB, Bergenstal RM, Edelman D, Davidson MB. A new look at screening and diagnosing diabetes mellitus.
    J Clin Endocrinol Metab. 93(7): 2447-53, 2008
  25. www.ngsp.org/certified.asp
  26. www.ngsp.org/prog/factors.htm